MEFの準備

(1)凍結してあるMEFをwake upする。起こした1mlチューブ１本は２段階で10枚までexpandできる（目安）。最初は１枚もしくは２枚に撒く。不死化等の処理を行なっていないMEFは特に細胞濃度が薄いと増殖能が悪い。

(2) コンフルエントに達した段階で4枚程度にexpandする。

(3) (2)がコンフルエントに達したら、10枚までexpandする。

   このとき、1 dishあたり最低でも1×106/ml程度の細胞濃度を確保すること。

マイトマイシンC処理

(4) (3)がコンフルエントに達したら、DNA合成/細胞分裂を阻害するためのマイトマイシンC処理を行う。

使用する試薬はM0503-2MG（SIGMA-ALDRICH®）

・バイアルにはマイトマイシンCが2mgとNaCl 48mgが入っている。

・5mlの1×PBS(-)で溶解する（→濃度が400μg/mlになる）。

紫色の固形物が生じるので出来るだけ溶かすようにする。

溶けたら50mlチューブに移す（使用した余りは凍結保存すれば数回使用可能）。

(5) 各dishに終濃度10μg/ml(プロトコルによって4μg/ml)はになるようにマイトマイシンC溶液を加え、dish　内の培地を混ぜる。2時間15分インキュベーター内で静置する。

(6) １×PBS(-)で２回洗浄後、DMEM-10％FBS培地に戻しインキュベータ　　　　　　   　　

   ー内で一晩静置する（※一晩置くことでマイトマイシンCによるダメージをややリカバーできる）。

(7) 細胞を１×PBS(-)で洗浄後、PBSを除いてから0.05％トリプシンを1ml加え、インキュベーター内で5分間処理する。

※0.05％トリプシン溶液は、0.5％トリプシン-5.3M EDTA（ナカライ: 35556-44,フェノールレッド不含）を1×PBS(-)で10倍希釈して使用する。

(8) 15ml or 50mlチューブに細胞溶液を集める。800×gで5分間遠心の後、dish1枚分あたりセルバンカー1ml程度で細胞ペレットをsuspendし、クライオチューブで凍結保存する（チューブ1本あたり3×106個程度入るようにする）。