STEMCCAを用いたマウスiPS細胞の作成
１日目
コンフルエントに達した４枚の293T細胞を21枚にexpandする。Dish一枚あたりの細胞数が3×106個になるようにする。18枚をSTEMCCA、3枚を遺伝子導入指標のcop GFPに用いる。
２日目
① opened(無血清・無抗生物質)のDMEMを使う分だけ50ml チューブに分注しておく。（コンタミ防止のため）
② 1.5mlチューブにDNA Solutionを作成する。
Tube 1
HIV-gp 20μl (2×18＝36μg分必要、濃度1,800ng/μlなので)
pCMV-VSV-G-REV 20μl (2×18=36μg分必要、濃度1,800ng/μlなので)
STEMCCA-loxP 36μl (2×18=36μg分必要、濃度1,000ng/μlなので)
Tube 2
HIV-gp 3.4μl (2×3＝6μg分必要、濃度1,800ng/μlなので)
pCMV-VSV-G-REV 3.4μl (2×3=6μg分必要、濃度1,800ng/μlなので)
pCDH-MCS-EF1-copGFP 12μl (2×3=6μg分必要、濃度500ng/μlなので)
③ 50mlチューブに１.のDMEMを14.6ml（800μl×18）、15mlチューブに2.4ml（800μl×3）用意する。
④ PEIを50mlチューブには324μl（18×18）、15mlチューブには54μl（18×3）加え、5分間静置する。（時間を正確に！！）
⑤ ④のチューブに②のDNA Solutionを加え、15分間静置する。（時間を正確に！！）
⑥ 用意してある293T細胞のdishに⑤を800μlずつ加え、すぐに混ぜる。（無血清培地に細胞を長く晒すと細胞が死ぬ、最後に100回ほど振って混合する）
４日目
ホルスコリン溶液を準備する。
ホルスコリン (和光: 063-02193) 25 mgをDMSO (SIGMA: D2650 Hybri-Max) 6 mlに溶解。1/1000溶液として、培養液に加える。CMVプロモーターの活性を高めて、ウィルスのパッケージング効率を上昇させる。（最終的に６mlになるように作る、ホルスコリンのビンには６ml入らないので、少しずつ加えて溶解させたら15mlチューブと行き来させて全量を溶かし調整する）
①50mlチューブにDMEM-10％FCS（つまり通常培養に用いてるもの）を35ml分注する（dish３枚分）。
②①にホルスコリン溶液を35μl加える。
③古い培地を捨て、②を10.5mlずつ各dishに加える（壁面からゆっくり）。
④①〜③をSTEMCCA６セット（18枚）、copGFP１セット（３枚）分行う。
⑤さらに48時間培養する。
６日目
ウィルス濃縮液（４xPEG）の用意
※レンチウィルス濃縮液は市販されているが高価である。
1L作っても良いが溶解に非常に時間がかかるので500mlで記す。
①500ml量れるビーカーやフラスコ、メートルグラスを用意する。
②①の容器にスターラーバーを入れる。
③PEG-6000（ナカライテスク:28254-85）を160g入れ、320mlまで超純水を加える（最終的に500mlに調整するので400ml程度まで加えても良い）。
ここで撹拌を開始し完全に溶解させる。ここで固形物を残したまま以降の過程に移るとHEPESが永遠に溶けなくなる。高濃度のため粘性が高く、撹拌の際小さな泡が生じ、粉と混同しやすいので注意する。
④5M NaClを40ml加えてまた完全に溶解する。
⑤20mlの1M HEPESを加え、また完全に溶解する。
HEPESは自分で調整しても良いが、劣化とコンタミ防止のため調整済の試薬を推奨する。（ナカライテスク:17557-94）
⑥必要に応じて1M NaOHでpHを7.4に調整する。
⑦超純水で500mlラインまでfill upする。
⑧オートクレーブ可能なビンに移してオートクレーブし、冷暗所で保存する。（HEPESを含む液体は長時間の光曝露で過酸化水素を発生させるため）
ウィルス液の回収（※ウィルスに関わる作業は手袋をつけること！）
①蛍光顕微鏡でcopGFPの蛍光を確認し、ウィルス産生を確認する。
②コンタミしていないかどうか確認し、dish３枚分の培地を１本の50mlチューブにまとめる。（STEMCCA６本、copGFP１本になる）
25mlシリンジで培地を吸い、0.45μm Minisart（ザルトリウス：17598）を通し、新しい50mlチューブに移す。シリンジとフィルターはdish６枚分使用したら、新しいものを使う（財政面を考慮したただの目安である）。
③それぞれの50mlチューブに上記ウィルス濃縮液をウィルス液の1/3相当量加
える。濃縮液は分注前によく混合し、また加えてからもよく混ぜる。４℃で一晩置く。帰宅時、登校時など機を見て時々混ぜること。
ターゲット細胞の準備
①コンフルエントになっている細胞をトリプシン処理、遠心して集める。
②6 well plateに各well１mlずつ通常培地を加えた後、細胞が１×105個/wellになるように細胞溶液を加える（targetを不死化させている場合は薄めに撒く）。
③plateを振り、細胞が均等になるようにする。翌日感染に用いる。
７日目
ウィルス液の回収（続き）
①ウィルス液をもう１度混ぜ４℃、3,500rpmで１時間遠心する。
②デカントで上清を捨てる（廃棄の際は不活化処理を忘れないこと）。
③ペレットに１mlのDMEM-FCSを加え、ペレットを剥がす程度に少しsuspendする。
④③をそれぞれ１本のチューブに集め（STEMCCA６ml、copGFP１ml）suspend、さらにDMEM-FCSを加え、STEMCCA９ml、copGFP1.5mlにfill upする。
⑤④に1/1000相当量のポリブレンを加え（STEMCCA９μl、copGFP1.5μl）、感染に使用する。
ターゲット細胞へのウィルス感染
①前日用意したターゲット細胞の培地を除く（乾燥しやすいので２wellずつ作業する）。
②上記ウィルス液を1.5mlずつwellに加える。STEMCCAを４well、copGFPを１well、controlを１wellとする。
③48時間感染を行う。
９日目
mouse KSR based iPS mediumを作成する。
DMEM 500 ml
KSR 75 ml (15 %当量)
非必須アミノ酸 ５ml
β-メルカプトエタノール(200倍希釈) １ml
抗生物質-抗真菌剤混合溶液 ５ml
（L-グルタミン ５ml）← 入れなくてもあまり変わらない
を加え、基本培地とする。
※培地作成時の注意
・非必須アミノ酸は結晶化していることがあるので確認して使う。
・β-メルカプトエタノールは原液（ナカライ：21438-82）を200倍希釈のち、0.22μmのフィルターでろ過滅菌して保存・使用する。
培地交換時に基本培地を必要分とり、以下４つの試薬を1/1000量加えて交換する。
LIF (参照http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/bai/article/LIF.htm)
PD0325901 (参照http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/product/life/ES_iPS/index.htm)
CHIR99021(同上)
Thiazovivin（同上）
※注意
LIF以外の３つの試薬はDMSOに溶解しており、わずかながら細胞毒性をもつ。目安として加えるDMSO溶解の試薬は1/1000量基準で５種類までにすること。
また、不死化していない細胞に感染させた場合、レンチウィルスによるダメージと、FBS10%→KSR15%の浸透圧変化で細胞が剥離してしまうことがある。場合によっては初回の培地交換は通常のDMEM-10%FBSに上記4試薬を加えたものにする。
培地交換の間隔は、最初の１週間は中２日ほどで良いが、次の週から中１日、コロニーを複数確認したら毎日にする。
（２週間ほど待ってみてコロニー出現が確認出来なければ失敗と見なしリトライしたほうがよい）