SV40発現レトロウイルスを用いた初代培養細胞の不死化 A. HEK293T細胞の準備 (1) -135℃に保存してある保存してあるHEK293T細胞を10cmディッシュ1枚に起こす。 (2) コンフルエントに達したら、10cmディッシュ4枚 → 15枚と継代する。継代間隔は中一日。そのうち12枚はSV40導入のため、3枚はVenus導入 (遺伝子導入効率の指標) のために用いる。一枚あたり3 × 106 細胞/10cmディッシュになるように15枚に細胞を播種する。翌日、トランスフェクションに用いる。 B-1. SV40発現レトロウイルスの作成 (1) 15 mlチューブに血清の入っていないDMEM培地 (液体培地そのまま) (ナカライ: 08459-06) を9.6 ml (800 µl × 12) を移す。 (2) (1)の培地にpolyethylenimine (PEI) を216 µl (18 µl × 12) を加える。 (3) 室温で5分間放置する。 (4) DNA溶液を加える。偏ったパッケージングにならないよう、DNA溶液をあらかじめ混合しておき、一度にPEI-DMEM混合溶液に加える。 pCL10A1: 36 µg (3 µg × 12) pSV40-Retro: 36 µg (3 µg × 12) (5) 室温で15分間放置する。この間に、培養細胞の状態を確認。50%コンフルエント程度が理想。 (6) このリポフェクション溶液を、各ディッシュに800 µlずつ側面からゆっくりと加えていく。 (7) 100回程度、ディッシュを振り、よく混ぜる。 (8) 48時間培養。 B-2. Venus発現レトロウイルスの作成 (1) 15 mlチューブに血清の入っていないDMEM培地 (液体培地そのまま) 2.4ml (800 µl × 3) を移す。 (2) (1)の培地にPEIを54 µl (18 µl × 3)を加える。 (3) 室温で5分間放置する。 (4) DNA溶液を加える。偏ったパッケージングにならないよう、DNA溶液をあらかじめ混合しておき、一度にPEI-DMEM混合溶液に加える。 pCL10A1: 9 µg (3 µg × 3) pMXs-Venus: 9 µg (3 µg × 3) (5) 室温で15分間放置する。この間に、培養細胞の状態を確認。50%コンフルエント程度が理想。 (6) このリポフェクション溶液を、各ディッシュに800 µlずつ側面からゆっくりと加えていく。 (7) 100回程度、ディッシュを振り、よく混ぜる。 (8) 48時間培養。　ウイルス回収用培地への交換 (B-1, B-2共通) 　48時間後に培地交換を行う。一度に全てのディッシュの培地を吸うと乾燥してしまうため、３枚ずつ行う。 (9) 手袋を装着し、DMEM培地 (10% FCS、抗生物質含有) (以下DMEM-FCS) を35 ml (3本分)をチューブに移す。培地の作製方法については「基本編 DMEM培地作成法」を参照すること。 (10) 培地にホルスコリン溶液 (※1) 35 µl (3本分) 加える。 (11) ディッシュを傾けながら、中の培地をピペッターでゆっくり吸い、廃液用に用意した容器に捨てる (※2)。 (12) ピペッターの液体を出す出力をゼロにする。続けてホルスコリンを加えた新しい培地を10.5 mlずつ、壁を伝わせゆっくりと加えていく。 (13) (9)−(12)を繰り返す。 (14) さらに48時間培養。 (※1) ホルスコリン溶液：ホルスコリン (和光: 063-02193) 25 mgをDMSO (SIGMA: D2650 Hybri-Max) 6 mlに溶解。1/1000溶液として、培養液に加える。CMVプロモーターの活性を高めて、ウイルスのパッケージング効率を上昇させる。 (※2) 廃液は塩素処理もしくはオートクレーブ処理によりウイルスの不活化を行う。 C. ウイルス液の回収・保存 (1) 培地がコンタミしていないか確認し、ディッシュ3枚分の培地を1本の50 mlチューブにまとめる (SV40 12枚から4本、Venus 3枚から1本)。培地はコンタミしたように黄色になる。 (2) ディッシュにPBSを10 ml加え、蛍光顕微鏡でウイルス産生を確認する。pMXs-Venusを入れたものではFITC用フィルターで蛍光が観察される。 (3) チューブから25 mlシリンジで培地を吸い、0.45 µm Minisart (ザルトリウス: 17598) を通し、培地を新しい50 mlチューブに移す。シリンジと0.45 µm Minisartは2本分透過したら、新しいものに変える。 (4) 50 mlチューブにウイルス濃縮液 (※3)を10 mlずつ加える。PEGが沈みやすいので、ウイルス濃縮液は加える前、また、加えた後、よく混ぜる。 (5) 4℃で一晩保存。時々混ぜる。 (6) 冷却遠心機で3,500 rpm、1時間遠心。 (7) 上清を捨てる。上清は不活化処理する。ウイルスの凍結保存を行う場合 → (11)へ。 (8) ペレットに1 mlのDMEM-FCSを加えて懸濁。 (9) 懸濁液を1本のチューブに集め (SV40 4 ml、Venus 1 ml) 、さらにDMEM-FCSを加え、SV40は6ml, Venusは1.5mlにフィルアップ。 (10) SV40は6 µlのポリブレン (4 mg/ml) を加える。Venusは1.5 ulのポリブレン溶液を加える。感染に使用。オプション(ウイルスを凍結保存する場合) (11) 終濃度が5%となるようにDMEM-FCSにDMSOを加え、凍結用培地を5 ml作る (DMSO 250 µlを4.75 mlのDMEM-FCSに加える) 。 (12) (7)で得られたペレットに1 mlずつ保存用培地を加える。ペレットをピペッティングにて溶解。SV40は4 ml、Venusは1 mlの容量になる。 (13) セラムチューブにSV40は0.3 mlずつ、Venusは0.15 mlずつ分注して-80℃フリーザーにて保存 (もしあれば-135℃フリーザーの方が好ましい)。使用時は37℃で解凍し、ターゲット細胞の培養に用いる培地を加えて10倍希釈する。1/1000容のポリンブレンを加えて、標的細胞へ感染。 (※3) ウイルス濃縮液の調製 [1] 320 mlの50% PEG 6000 (ナカライ: 28254-85)を準備する。 [2] 5M NaClを40 ml加える。 [3] 1M HEPES (ナカライ: 17557-94)を20 ml加える。 [4] 500 mlにフィルアップする。 [5] オートクレーブする。 D. ターゲット細胞の準備 (1) 10cmディッシュにて培養していたターゲット細胞の培地をアスピレーターで取り除き、PBSでwash、0.05 %トリプシンを800 µl加え、CO2インキュベーターで5分間静置し、細胞を剥がす。 (2) 血清入り培地を5.2 ml加える。4℃, 1,100 rpmで5分間遠心。 (3) 上清を捨て、1 × 105細胞/mlになるようにペレットを培地に懸濁、希釈する。 (4) 6 wellプレートの各ウェルに1 mlずつ培地を入れておき、細胞懸濁液を1 mlずつ加える。 (5) 100回程度、ディッシュを縦横に振り、よく混ぜる。 E. ターゲット細胞へのウイルス感染 (1) 前日に6 wellプレートに播種したターゲット細胞の培地を除く。ただし、乾燥しやすいので2 wellずつ作業を行う。 (2) ポリンブレンを加えたウイルス溶液を各wellに1.5 mlずつ加える。 (3) wellの1-4番はSV40、5番はVenus、6番は未感染とし、必ずコントロールをとる。 (4) 感染は48時間行う。 (5) 通常のDMEM-FCS培地へ交換。 (6) 抗生物質G418を最終濃度600 µg/mlとなるように加えた培地へ交換。コントロールのwellで細胞が完全に死滅するまで選択を続ける。 (7) コンフルエントになったら10倍希釈して継代する。継代途中の細胞も一部保存しておく。継代していく中で、形態に変化がないかどうか常に注意を払うこと。

SV40発現レトロウイルスを用いた初代培養細胞の不死化

A. HEK293T細胞の準備

(1) -135℃に保存してある保存してあるHEK293T細胞を10cmディッシュ1枚に起こす。

(2) コンフルエントに達したら、10cmディッシュ4枚 → 15枚と継代する。継代間隔は中一日。そのうち12枚はSV40導入のため、3枚はVenus導入 (遺伝子導入効率の指標) のために用いる。一枚あたり3 × 106 細胞/10cmディッシュになるように15枚に細胞を播種する。翌日、トランスフェクションに用いる。

B-1. SV40発現レトロウイルスの作成

(1) 15 mlチューブに血清の入っていないDMEM培地 (液体培地そのまま) (ナカライ: 08459-06) を9.6 ml (800 µl × 12) を移す。

(2) (1)の培地にpolyethylenimine (PEI) を216 µl (18 µl × 12) を加える。

(3) 室温で5分間放置する。

(4) DNA溶液を加える。偏ったパッケージングにならないよう、DNA溶液をあらかじめ混合しておき、一度にPEI-DMEM混合溶液に加える。

pCL10A1: 36 µg (3 µg × 12)

pSV40-Retro: 36 µg (3 µg × 12)

(5) 室温で15分間放置する。この間に、培養細胞の状態を確認。50%コンフルエント程度が理想。

(6) このリポフェクション溶液を、各ディッシュに800 µlずつ側面からゆっくりと加えていく。

(7) 100回程度、ディッシュを振り、よく混ぜる。

(8) 48時間培養。

B-2. Venus発現レトロウイルスの作成

(1) 15 mlチューブに血清の入っていないDMEM培地 (液体培地そのまま) 2.4ml (800 µl × 3) を移す。

(2) (1)の培地にPEIを54 µl (18 µl × 3)を加える。

(3) 室温で5分間放置する。

(4) DNA溶液を加える。偏ったパッケージングにならないよう、DNA溶液をあらかじめ混合しておき、一度にPEI-DMEM混合溶液に加える。

pCL10A1: 9 µg (3 µg × 3)

pMXs-Venus: 9 µg (3 µg × 3)

(5) 室温で15分間放置する。この間に、培養細胞の状態を確認。50%コンフルエント程度が理想。

(6) このリポフェクション溶液を、各ディッシュに800 µlずつ側面からゆっくりと加えていく。

(7) 100回程度、ディッシュを振り、よく混ぜる。

(8) 48時間培養。

　ウイルス回収用培地への交換 (B-1, B-2共通)

　48時間後に培地交換を行う。一度に全てのディッシュの培地を吸うと乾燥してしまうため、３枚ずつ行う。

(9) 手袋を装着し、DMEM培地 (10% FCS、抗生物質含有) (以下DMEM-FCS) を35 ml (3本分)をチューブに移す。培地の作製方法については「基本編 DMEM培地作成法」を参照すること。

(10) 培地にホルスコリン溶液 (※1) 35 µl (3本分) 加える。

(11) ディッシュを傾けながら、中の培地をピペッターでゆっくり吸い、廃液用に用意した容器に捨てる (※2)。

(12) ピペッターの液体を出す出力をゼロにする。続けてホルスコリンを加えた新しい培地を10.5 mlずつ、壁を伝わせゆっくりと加えていく。

(13) (9)−(12)を繰り返す。

(14) さらに48時間培養。

(※1) ホルスコリン溶液：ホルスコリン (和光: 063-02193) 25 mgをDMSO (SIGMA: D2650 Hybri-Max) 6 mlに溶解。1/1000溶液として、培養液に加える。CMVプロモーターの活性を高めて、ウイルスのパッケージング効率を上昇させる。

(※2) 廃液は塩素処理もしくはオートクレーブ処理によりウイルスの不活化を行う。

C. ウイルス液の回収・保存

(1) 培地がコンタミしていないか確認し、ディッシュ3枚分の培地を1本の50 mlチューブにまとめる (SV40 12枚から4本、Venus 3枚から1本)。培地はコンタミしたように黄色になる。

(2) ディッシュにPBSを10 ml加え、蛍光顕微鏡でウイルス産生を確認する。pMXs-Venusを入れたものではFITC用フィルターで蛍光が観察される。

(3) チューブから25 mlシリンジで培地を吸い、0.45 µm Minisart (ザルトリウス: 17598) を通し、培地を新しい50 mlチューブに移す。シリンジと0.45 µm Minisartは2本分透過したら、新しいものに変える。

(4) 50 mlチューブにウイルス濃縮液 (※3)を10 mlずつ加える。PEGが沈みやすいので、ウイルス濃縮液は加える前、また、加えた後、よく混ぜる。

(5) 4℃で一晩保存。時々混ぜる。

(6) 冷却遠心機で3,500 rpm、1時間遠心。

(7) 上清を捨てる。上清は不活化処理する。ウイルスの凍結保存を行う場合 → (11)へ。

(8) ペレットに1 mlのDMEM-FCSを加えて懸濁。

(9) 懸濁液を1本のチューブに集め (SV40 4 ml、Venus 1 ml) 、さらにDMEM-FCSを加え、SV40は6ml, Venusは1.5mlにフィルアップ。

(10) SV40は6 µlのポリブレン (4 mg/ml) を加える。Venusは1.5 ulのポリブレン溶液を加える。感染に使用。

オプション(ウイルスを凍結保存する場合)

(11) 終濃度が5%となるようにDMEM-FCSにDMSOを加え、凍結用培地を5 ml作る (DMSO 250 µlを4.75 mlのDMEM-FCSに加える) 。

(12) (7)で得られたペレットに1 mlずつ保存用培地を加える。ペレットをピペッティングにて溶解。SV40は4 ml、Venusは1 mlの容量になる。

(13) セラムチューブにSV40は0.3 mlずつ、Venusは0.15 mlずつ分注して-80℃フリーザーにて保存 (もしあれば-135℃フリーザーの方が好ましい)。使用時は37℃で解凍し、ターゲット細胞の培養に用いる培地を加えて10倍希釈する。1/1000容のポリンブレンを加えて、標的細胞へ感染。

(※3) ウイルス濃縮液の調製

[1] 320 mlの50% PEG 6000 (ナカライ: 28254-85)を準備する。

[2] 5M NaClを40 ml加える。

[3] 1M HEPES (ナカライ: 17557-94)を20 ml加える。

[4] 500 mlにフィルアップする。

[5] オートクレーブする。

D. ターゲット細胞の準備

(1) 10cmディッシュにて培養していたターゲット細胞の培地をアスピレーターで取り除き、PBSでwash、0.05 %トリプシンを800 µl加え、CO2インキュベーターで5分間静置し、細胞を剥がす。

(2) 血清入り培地を5.2 ml加える。4℃, 1,100 rpmで5分間遠心。

(3) 上清を捨て、1 × 105細胞/mlになるようにペレットを培地に懸濁、希釈する。

(4) 6 wellプレートの各ウェルに1 mlずつ培地を入れておき、細胞懸濁液を1 mlずつ加える。

(5) 100回程度、ディッシュを縦横に振り、よく混ぜる。

E. ターゲット細胞へのウイルス感染

(1) 前日に6 wellプレートに播種したターゲット細胞の培地を除く。ただし、乾燥しやすいので2 wellずつ作業を行う。

(2) ポリンブレンを加えたウイルス溶液を各wellに1.5 mlずつ加える。

(3) wellの1-4番はSV40、5番はVenus、6番は未感染とし、必ずコントロールをとる。

(4) 感染は48時間行う。

(5) 通常のDMEM-FCS培地へ交換。

(6) 抗生物質G418を最終濃度600 µg/mlとなるように加えた培地へ交換。コントロールのwellで細胞が完全に死滅するまで選択を続ける。

(7) コンフルエントになったら10倍希釈して継代する。継代途中の細胞も一部保存しておく。継代していく中で、形態に変化がないかどうか常に注意を払うこと。