プラスミド抽出法（マキシプレップ）

使用キット／アクセサリ

FastlonTM Plasmid Maxi Kit (RBC Bioscience)

PureLinkTM Nucleic Acid Purification Rack (invitrogenTM)

遠心ボトル（NALGENE®）

Protocol

集菌•カラム平衡化

１. 培養で増やしたフラスコ内の菌液を、250ml遠心ボトルに移す（フラスコ内に菌を残さないようにフラスコを揺らして混合しておく）。その後、4,800rpmで15分間遠心する。

２. PM Columnを核酸精製ラックに設置する（カラムは直接50ml遠沈管に差してもいいが、ラックは廃液をまとめて処理できる利点がある）。

３. PEQ Buffer 10mlを注いでカラム平衡化を行い、重力流によりPM ColumnからPEQ Bufferを排出する。

４. 廃液を捨てる。

再懸濁

５. （RNase Aを加えた）PM1 Buffer 10mlを加え、ピペッティングで細胞ペレットを再懸濁させる。ペレットが固いので注意して念入りに行う。溶液を全量50mlチューブに移す。

溶菌

６. PM2 Buffer 10 mlを加えて、混合する。少しずつ混合し、液体が固まらないように行うこと！！ここがもっとも注意深く行わなくてはならない部分である。一気に加えると液体の粘度が急上昇し、混合が非常に難しくなり、結果変性が十分に起こらず、回収量が落ちる。

７. 混合が十分に行われたことを確認したら、溶液が透明になるまで待つ。

中和

８. PM3 Buffer 10mlを加え、転倒混和する。

９. 14,000rpm程度で15〜20分間遠心する。

DNA結合

10. 溶液（上清）を平衡化済みのPM Columnに加え（上清はいったん別の50ml tubeに移したほうが安全である、キムワイプなどを簡易ろ紙として用いると沈殿の混入を簡単に防止できる）、重力流により溶液を排出する。

11. 廃液を捨てる。

洗浄

12. PM ColumnにPW Buffer 30mlを加え、洗浄する。重力流によりPM ColumnからPW Bufferを排出する。

13. 廃液を捨てる。

DNA溶出

14. PM Columnを新しい遠心管に移し入れ、PEL Buffer10mlを加え、重力流によりDNAを溶出させる。

DNA沈殿

15. イソプロパノール7.5ml（0.75量）を加え、DNAを沈殿させる。DNAの純度を求める場合はすぐに次の手順へ、しかし回収量を求める場合は氷中に静置し沈殿を待つ。

16. 4℃、15,000rpmで30分間遠心する。遠心する前に、沈殿が起こる側にマジックで印をつけ、その側が最外になるようにセットするといい。

17. 印が上にくるようにチューブを傾け、慎重にアスピレーターで上清を取り除き、チューブ内をドライヤーで乾燥させる（DNA沈殿物が透明になるくらいが目安）。

18. DEPC水を500〜1000μl、DNA沈殿物に当たるように注入する。この際の水の流れた痕跡でDNA沈殿物の有無をもう一度確認する。

19. DNA沈殿物が、注入したDEPC水に浸かるようにうまく傾きを調整し、冷蔵庫（4℃）で一晩静置する。翌日溶解しているかを確認し、溶解していなければもう一晩静置する。