6 well plateでのmouse iPSCsの維持＆継代

1．コンフルエントに達するまで毎日培地を交換する。

2．継代予定日の前日までにfeeder細胞を用意する。

3．コンフルエントに達したらwellの培地を除き、1x PBSを2 ml/well用いて洗浄する。

（wellの端のコロニーが崩れていたり、密集したコロニーが融合していたりコロニーの色が黒っぽくなってきたりしていたらコンフルエントでなくても継代すること）

4．0.05％トリプシン（0.5％-Trypsin/5.3mM-EDTA Solution、ナカライ35556-44を1x PBSで10倍希釈）を500μl加え、37℃インキュベーターで5分間静置する。

5．Plateをタッピングし、細胞を底面から剥がす。

6．iPSCs用培地を500μl加えて、細胞液を滅菌済の1.5mlチューブに全量回収する。

7．800xgで5分間遠心する。

8．細胞ペレットに注意して上清を除き、培地を1ml加えてsuspendする。

9．細胞数を計測し、4×104個程度の細胞を新たなwellに撒き、よくplateを振って均一にする。

　（これが非常に重要、均一に撒けないとコロニーの成育が不十分なまま継代　 を迫られることになる）

10. 均一に撒けていることを顕微鏡で確認し、37℃インキュベーターに戻す。

（均一に撒けていたら３〜４日目には再びコンフルエントに達するはずである）